Поправьте мне геном

БИОЛОГИ НЕ С НУЛЯ придумали CRISPR/Cas9. Изначально это система противовирусной защиты у бактерий и архей, часто ее называют бактериальным иммунитетом. Иммунная система животных работает совсем иначе, однако у них есть кое-что общее: и для нашего иммунитета, и для бактериальной CRISPR/Cas9 все начинается с того, что нужно как-то распознать чужака. Чужак – это бактериофаг, вирус, специализирующийся на бактериях. Вирус впрыскивает в бактерию свою нуклеиновую кислоту (ДНК или РНК) – в ней закодированы гены белков, необходимые для размножения вирусного генома и формирования вирусных частиц. Если бактерия вовремя заметит чужую ДНК или РНК и уничтожит ее, то гибель от вируса ей не грозит.

Как бактерия узнает чужую нуклеиновую кислоту? По ее последовательности. ДНК и РНК представляют собой длинные цепочки из четырех нуклеотидов (химических групп), и чередование этих нуклеотидов дает уникальные последовательности генов. Бактерии, чтобы узнать вирус, не обязательно «читать» весь его геном, достаточно какого-то кусочка. Так мы, открыв книгу без обложки, быстро поймем, с чем имеем дело, если увидим в каком-нибудь предложении имя Анны Карениной.

И ТУТ МЫ, НАКОНЕЦ, подошли к тому, что такое CRISPR. Это участки в бактериальной ДНК, хранящие куски вирусных геномов, своего рода картотека вирусов. Когда вирус-фаг нападает на бактерию, она не обязательно гибнет – бывает, что вирус терпит неудачу, его ДНК (для простоты говорим только о фагах, у которых геном в виде ДНК) начинает разрушаться, и тогда в распоряжении у бактерии появляются фрагменты вирусной ДНК. Бактерия эти куски не уничтожает, а встраивает в собственную хромосому. Выше мы говорили, что CRISPR – это «короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами». Палиндромами называют последовательности нуклеотидов, которые одинаково читаются от конца к началу и от начала к концу, например, как слово «топот». Эти палиндромы перемежаются другими последовательностями ДНК, так называемыми спейсерными участками. И вот как раз спейсеры и есть остатки вирусов, записанные в бактериальную ДНК. ОПИСАНИЕ СХЕМАТИЧНО, но его достаточно, чтобы понять, почему биоинженеры не могли пройти мимо CRISPR/Cas. Ведь каким должен быть идеальный метод для генетического редактирования? Во-первых, он должен быть точным: если мы хотим внести изменения, например, в ген белка глобина, то мы должны быть уверены, что изменения не появятся заодно в гене какого-нибудь пищеварительного фермента. Во-вторых, метод должен быть универсальным, чтобы с его помощью можно было редактировать любую последовательность в ДНК любого организма. В-третьих, он должен быть простым и быстрым. И все это дает нам система CRISPR/Cas. Выше мы говорили, что у нее есть много разновидностей, более сложных и менее сложных. Один из самых простых вариантов CRISPR/Cas – тот, что нашли в бактерии Streptococcus pyogenes (вызывает скарлатину и другие болезни): эта бактерия пользуется белком Cas9, который сам ищет нужную последовательность в ДНК и сам же ее разрезает. Именно Cas9 приспособили для работы в клетках животных и растений.


НО ДО СИХ ПОР МЫ говорили о CRISPR/Cas как о системе защиты – она портит, уничтожает чужую ДНК, проникшую в бактериальную клетку. А о биотехнологической CRISPR/Cas9 мы обычно слышим, что она исправляет неправильную ДНК. Как вышло, что уничтожитель стал редактором? Представим, что нам нужно с помощью CRISPR/Cas9 в каком-то гене исправить мутировавший фрагмент: убрать неправильную генетическую букву и поставить на ее место правильную. Никакой библиотеки CRISPR тут уже нет – мы сами синтезируем РНК, которая по своей последовательности совпадает с мутантным участком в ДНК. Эта РНК будет путеводителем для белка Cas9 – мы вручаем ее белку и отправляем их в клетку. Но кроме того, мы отправляем в клетку образец ДНК – копию той последовательности, которую собираемся отредактировать, но не в мутантном, а в правильном виде.

Cas9 находит нужный участок и режет ДНК, при этом ничего не вырезает и не вставляет. Разрывы запускают системы ремонта (репарации) ДНК, которые есть в каждой клетке. Но клетка не просто сшивает разрыв – она заменяет целый кусок ДНК, в который входят и место разрыва, и еще несколько десятков генетических букв по обе стороны от него. Вместо поврежденного фрагмента синтезируется новый на замену. Но для синтеза необходим шаблон с нужной последовательностью, и вот тут в дело вступает тот образец ДНК, который мы ввели в клетку вместе с Cas-белком. Иными словами, система CRISPR/Cas9 нужна для того, чтобы включить клеточные механизмы ремонта генома, которые в определенном месте перепишут ДНК в соответствии с нашими указаниями. Вот так это все и работает.

СИНТЕЗИРОВАТЬ РНК И ДНК нужной последовательности сейчас очень просто, особенно если нужны небольшие цепочки – а система CRISPR/Cas9 работает как раз с короткими фрагментами нуклеиновых кислот. Внедрить их вместе с белком в клетку – тоже довольно рутинная процедура. Синтезируя те или иные РНК для Cas9, можно изменить абсолютно любую последовательность. 

Кроме CRISPR/Cas9, есть и другие системы исправления генома, но у них поиск места для редактирования основан на взаимодействии белка и ДНК – то есть белковая молекула сама ищет нужную последовательность. Создавать такие белки долго и трудоемко. В случае же CRISPR/Cas9 поиск ведет не белок, а РНК, которую можно синтезировать быстро и с любой последовательностью.

СИСТЕМУ БАКТЕРИАЛЬНОГО иммунитета изучают с конца 1980-х, а «геномным редактором» она стала уже в XXI веке – в 2012 году в журнале Science вышла статья с описанием того, как бактериальную CRISPR/Cas9 приспособить для биотехнологических нужд. С тех пор не проходит недели, чтобы где-нибудь опубликовали работу, посвященную этой системе: ее модифицируют, совершенствуют, испытывают на разных клетках и пытаются исправлять с ее помощью какие-то вредные мутации. CRISPR/Cas9 испытывали на дрожжах, дрозофилах, круглых червях, табаке и рисе, на клетках мышей, свиней, собак и людей. Есть модификации, которые позволяют резать либо одну цепь ДНК, либо обе сразу, либо резать не ДНК, а РНК. Есть версии метода, в которых используется «увечный» фермент – он не режет нуклеиновую кислоту, зато связан с другим белком, который может включать или выключать активность тех или иных генов. Cas9 с помощью РНК-путеводителя приходит к нужному гену и просто садится на его ДНК, а белок-пассажир уже дальше делает свою работу.

ВКЛЮЧАЯ И ВЫКЛЮЧАЯ ГЕНЫ, внося в них разные мутации, мы лучше понимаем, как они работают в организме, как взаимодействуют между собой, и с CRISPR/Cas9 подобные исследования стали проходить намного быстрее. Если же говорить о практическом применении, то с помощью CRISPR/Cas9 предполагается, например, победить лекарственную устойчивость бактерий и лишить малярийных комаров способности переносить малярию. А что до того, как CRISPR/Cas9 использовать в медицине, – читатели легко сообразят, сколь огромные тут открываются перспективы в смысле исправления вредных мутаций, истребления раковых клеток и т. д. Эксперименты говорят, что такое вполне возможно. В 2014 году в Nature Biotechnology была опубликована статья о том, как мышей избавили от тирозинемии – болезни обмена веществ, при которой из строя выходят и почки, и печень, и нервная система: животным с помощью CRISPR/Cas9 исправили соответствующий кусок в ДНК. А весной этого года в Nature Communications вышла статья, авторы которой затормозили гибель фоторецепторов в сетчатке у мышей и предотвратили слепоту у животных, предрасположенных к пигментному ретиниту (наследственному заболеванию, заканчивающемуся слепотой). И эти два примера – лишь капля в море исследований, посвященных возможностям CRISPR/Cas9.

НО МЫШИ МЫШАМИ, а что же люди? Как только CRISPR/Cas9 появился в биотехнологии, всем стало ясно, что рано или поздно дело дойдет до человека, точнее – до человеческих эмбрионов. Конечно, и у взрослого организма генетический редактор можно доставлять в нужный орган или ткань. Но если заранее известно, что ребенок получится генетически больным, то почему бы не исправить ему гены в самом начале, еще в ходе экстракорпорального оплодотворения? Тут, однако, сразу возникают этико-юридические вопросы, связанные, скажем так, с проблемой самостоятельной субъектности эмбриона. Вопросы эти до поры до времени вяло тлели в научном сообществе, пока в 2015 году китайские исследователи из Университета Сунь Ятсена не опубликовали свою знаменитую работу, о которой мы говорили в начале. Никто не думал, что эмбрион человека отредактируют так скоро. Этико-юридические дискуссии вышли на новый уровень, а пока они шли, в Китае продолжили эксперименты – и, например, в 2016 году в Journal of Assisted Reproduction and Genetics вышла другая китайская работа, в которой говорилось, что оплодотворенную яйцеклетку человека можно снабдить мутацией, защищающей от ВИЧ. В конце концов было решено, что с определенными оговорками CRISPR/Cas9 можно применять к человеческим эмбрионам. И вот совсем недавно, в начале августа в Nature вышла статья с очередными отредактированными зародышами – на сей раз эксперименты выполняли в Орегонском университете науки и здоровья.