Поймать ДНК за хвост

Парадоксальное название инструмента вполне отражает суть. Оптический, или лазерный пинцет предназначен для захвата отдельных объектов, которые настолько малы, что сфокусированный луч света – единственное средство приложить к ним точно заданную по величине и направлению силу. Впрочем, те, кто работает с такими установками, предпочитают называть их оптическими ловушками. У лазерного пинцета нет двух «хватательных» поверхностей. Объект ловит и удерживает один луч. В упрощенном виде «матчасть» такова. Когда свет встречает на своем пути некое тело, их отношения развиваются по трем сценариям: поглощение, отражение или преломление. В последнем случае фотоны после встречи меняют траекторию, отклоняясь наружу от оптической оси (вспомните, как выглядит карандаш, до середины опущенный в воду), и одновременно передают часть импульса телу, подталкивая его в противоположную сторону. Если правильно сфокусировать луч на предмете, суммарное воздействие фотонов будет толкать его в центр луча и к точке фокуса, как бы запирая в трех измерениях. Именно это на практике осуществил Ашкин. Тогда же, в 1980-х принцип успешно попытались применить для манипуляции биологическими объектами. С тех пор технологию развивают. Например, в Петербургском политехническом университете (комплекс «Нанобиотехнологии»), где функционирует установка «Лазерный пинцет».

- Это как купить серийный автомобиль и превратить его в гоночный болид?

Основное помещение научно-исследовательского комплекса «НаноБио» похоже на биологическую лабораторию. На столах пробирки, перчатки. По соседству стоят инкубаторы, где развиваются какие-то сложные отношения между ДНК и ферментами. Нам же – по коридору и в подвал. В небольшой комнате – рабочее место с компьютером и нечто, напоминающее огромный стол, на котором «расставлены» микроскоп и целая куча устройств. Свет в ИК-спектре человеческим глазом не воспринимается, и хотя луч, прежде чем попасть в объектив микроскопа, проходит сложную траекторию над «столом» через зеркала и линзы, рассчитывать на «лазерное шоу» нечего.

В теории все самое интересное – на мониторе. Но я вижу только два темных  пятнышка на светлом фоне.

        Что изучают на установке «Лазерный пинцет»?

•         Механические свойства молекулы ДНК и ее взаимодействие с белками. "Если приложить достаточную силу, около 60 пиконьютонов, двойная спираль ДНК развертывается и превращается в две отдельные нити, - объясняет сут Георгий Побегалов. - При этом молекула удлиняется. Метод оптического пинцета позволил показать, что в это время там происходит раскручивание и образование локальных разрывов. Другой момент – взаимодействие ДНК с белком. Можно белок пометить флуорофором и увидеть, как он связывается с ДНК. Посмотреть, как из коротких молекул, мономеров, в точках нуклеации образуются белковые «нити» - филаменты."
•         Скелет» клетки. "Мы изучаем бактериальный цитоскелет методом субдифракционной микроскопии, - рассказывает аспирант Алексей Ведяйкин. - Один из белков цитоскелета – ftsZ. Бактерии, у которых он не синтезируется, удлиняются до нескольких десятков микрон вместо 2-4, но не могут разделиться. Причины две: первая – мутация, вторая – SOS-ответ. Когда у бактерии повреждена ДНК, высока вероятность, что при делении образуются две нежизнеспособные клетки. Процесс останавливается, пока ДНК ни будет отрепарирована. SOS-ответ во многом помогает бактериальным клеткам пережить воздействие антибиотиков."
•         Мембраны раковых клеток. Цитоскелет напрямую связан с мембраной клетки. От их свойств зависит, сможет ли клетка противостоять воздействию внешней среды. Аспирантка Наталья Морозова с помощью лазерного пинцета проверяет прочность мембраны раковых клеток печени человека: "У мембраны есть такие характеристики, как натяжение и вязкость. Они различаются у нормальных и раковых клеток. До сих пор эти параметры мерили не на клетках, а на выделенных фракциях их мембран. Мы же прикрепляем к конкретной клеточной мембране микросферу, а потом ее оттягиваем. Между шариком и клеткой образуется тонкая трубка  из мембраны. И мы можем измерить силу их взаимодействия при разных условиях."
•         Бактериальная «самооборона». "Некоторые бактерии обладают системой рестрикции-модификации – механизмом, позволяющим остановить атаку на колонию вируса-бактериофага. У бактерий, владеющих этой системой, с ДНК взаимодействуют два фермента, - объясняет Наталья Морозова. - Метилаза добавляет в определенных местах ДНК метильную группу (CH3). А рестриктаза режет ДНК в тех же местах, если метильной группы там нет. Это своего рода «охранная грамота». Когда клетку заражает вирус, его ДНК не метилирована, и рестриктаза разрушает чужеродный генетический материал. Но бывает, что система дает сбой, и ДНК бактериофага метилируется. Значит, его потомство сможет заразить другие клетки. Мы встраиваем в клетки E.Coli меченные ферменты. И на их примере при помощи флуоресцентной микроскопии выясняем, случаен ли этот процесс, или есть клетки-предатели, в которых, например, метилазы больше, чем рестриктазы."
•         Транскрипция ДНК.  Информация, записанная в ДНК, превращается в белки через несколько биохимических процессов. Один из них – синтез РНК на ДНК-матрице, которым заведует фермент РНК-полимераза. Их взаимодействие на «Лазерном пинцете» изучает Анатолий Арсениев: "Я пытаюсь отследить динамику движения полимеразы по молекуле ДНК. Конструирую небольшую молекулу по схеме: промотер (химический «старт»), ген, терминатор («стоп»). Заранее известна «дистанция». ДНК крепится «хвостом» к большой полимерной частице, а полимераза «сажается» на шарик поменьше. Когда начинается синтез, по тому, как меняется расстояние между шариками, можно судить о скорости движения полимеразы. Статистика экспериментов позволит понять, зависит ли эта скорость от последовательности «букв»-нуклеотидов, по которым проходит полимераза, или от действия внешних факторов."

ГРАНИЦА запретной зоны зовется «дифракционный предел разрешения» и является побочным эффектом волновой природы света. Разрешение – термин, знакомый нам из цифровой техники. Измеряется оно количеством пикселей – условно, светящихся точек, формирующих изображение. В сущности, все, что мы видим, можно разбить на такие точки. И если бесконечно увеличивать одну из них, в какой-то момент окажется, что точка – уже не точка. Излучаемый ею свет образует дифракционную картину: вокруг самого яркого пятна, диска Эйри, расходятся менее яркие концентрические кольца – как волны от брошенного в воду камня. Объект, который мы хотим рассмотреть, состоит из точек-камней, но все, что мы видим – это волны. Как при таких условиях отличить булыжник от высыпанного разом мешка гальки? Минимальный различимый для микроскопа размер «камешков» регламентирован по всей строгости физических законов. Он должен быть больше, чем половина длины волны видимого света – 200 нм. Для сравнения, размер какого-нибудь белка «в поперечнике» - около 10 нм. Проще говоря, ни черта не видно. Если, конечно, не обхитрить дифракционный предел. Например, бросать «камешки» по очереди. В мире аналогий «на двух пальцах» идея кажется немудрящей, но те, кто придумал, как осуществить это на уровне молекул, в 2014 году получили за свое открытие коллективного «нобеля» по химии. Еще раз поаплодируем румыну с немецкой «пропиской» Штефану Хеллю и американцам Эрику Бетцигу и Уильяму Мернеру, а сами вернемся в Политех, где методы субдифракционной микроскопии реализовались, когда будущие лауреаты еще и не готовились толкать речь перед Нобелевским комитетом.

КУПИТЬ машину, превратить в экскаватор и сделать так, чтобы на нем можно было участвовать в «Формуле-1». Примерно так звучит для меня история дальнейшего «апгрейда» установки «Лазерный пинцет», которую рассказывает Антон:

ПОЯСНИМ. «Внутренности» живых клеток трудно наблюдать в световой микроскоп не только потому, что они маленькие, но и потому, что практически прозрачные. В видимом диапазоне они мало чем отличаются от воды, в которой находятся. Как у медузы в море, у них нет контраста со средой. Но когда медузы становятся самыми яркими морскими гадами? Когда ночью святятся в воде. Подсветить клетки можно, например, используя способность биомолекул преломлять свет или менять его поляризацию (так устроены конфокальный и поляризационный микроскопы). Но можно напрямую сообщить клеточным структурам свойство светится.

- У нас тут несколько лазеров с разной длиной волны, - поясняет мне Георгий Побегалов, еще один аспирант лаборатории. Работа Георгия связана как раз с флуоресцентно меченной ДНК: