Аминокислоты (вещества, из которых состоят белки) могут существовать в двух формах (L и D). Долгое время считалось, что природное происхождение имеют только L-аминокислоты, а D- можно получить лишь искусственным путем. Однако, начиная с 1960-х гг., второй тип в небольших количествах начали обнаруживать в бактериях, растениях, животных и в человеке. Врачи предполагают, что его повышенное содержание – признак или даже одна из причин развития таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера, Пика и т. д. Чтобы лучше понять природу его накопления в нервных тканях, необходимо определять его содержание.
Сегодня для определения содержания аминокислот в той или иной жидкости используют метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуоресцентным или ультрафиолетовым детекторами. Его суть в том, что анализируемая смесь вводится в трубочку, заполненную специальным веществом. Там ее компоненты разделяются и выходят друг за другом в детектор, фиксирующий их появление в виде пиков. Такая последовательность пиков называется хроматограммой.
Чтобы флуоресцентный детектор обнаружил анализируемое вещество, оно должно ярко светиться в ответ на облучение, но большинство природных аминокислот (как серин) не обладают этими свойствами. Поэтому с помощью реагентов химическим путем их помечают флуорофором – соединением, способным испускать свет при облучении.
В качестве такого реагента часто использовали дансилхлорид. Однако продукты его реакции с аминокислотами не стабильны, что сильно снижает точность измерений. С этой проблемой позволяет справиться его аналог – дабсилхлорид. Ранее считалось, что его нельзя применять для выявления аминокислот флуоресцентным способом, поскольку он «гасит» свечение и детектор ничего не «видит». Однако политехники обнаружили, что поглощение света дабсилхлоридом настолько мощное, что он тушит даже фоновое излучение, причем так сильно, что сигнал детектора опускается вниз от базовой линии и на хроматограмме появляются так называемые отрицательные пики. По ним, как и по положительным, также можно определить наличие нужного вещества.
Ученые Пермского Политеха решили проверить возможность использования такого метода поиска D-аминокислот и сравнить его с традиционным – ультрафиолетовым. Для этого взяли несколько растворов, содержащих смесь L- и D-серина и записали хроматограмму с помощью ультрафиолетового и флуоресцентного детекторов.
– На первом детекторе мы обнаружили обычные пики, направленные вверх, а на втором – вниз. При этом глубина пика пропорциональна содержанию аминокислоты, что позволяет выполнять количественный анализ. Эксперимент повторяли несколько раз для пяти концентраций серина в диапазоне от 0,01 до 0,08 мг/мл, что соответствует реальным количествам аминокислот в биологических образцах. Мы выяснили, что погрешность определения D-серина ультрафиолетовым и флуоресцентным детектором практически одинакова и не превышает 8% для наименьшей концентрации (0,01 мг/мл) и менее 1% для наибольшей концентрации (0,08 мг/мл), – комментирует Леонид Аснин, доцент кафедры «Химия и биотехнология» ПНИПУ, кандидат химических наук.
Полученные показатели говорят о том, что флуоресцентный способ эффективен для выявления D-аминокислот так же, как ультрафиолетовый. Это позволяет проверять результаты обследований разными методами и повышать их точность.
Метод пока отработан на модельных растворах, но будет адаптироваться для реальных биологических жидкостей, таких как спинномозговая или плазма крови, а также для нервных тканей животных. Тогда его можно будет использовать в медицине и нейрофизиологии для изучения нейродегенеративных заболеваний и метаболических процессов в мозге.
Результаты ученых ПНИПУ помогут в разработке способов объективной диагностики (по содержанию D-аминокислот в биологических образцах) социально значимых болезней, например, Альцгеймера и Пика или дисциркуляторной энцефалопатии.
Статья опубликована в журнале «Journal of Chromatography A» за 2025 год.
Фото: Alvin Gogineni, Genentech, flickr.comЭто новость от журнала ММ «Машины и механизмы». Не знаете такого? Приглашаем прямо сейчас познакомиться с этим удивительным журналом.