Что общего у современного научпопа и гламурного журнала? Они нас обманывают. На иллюстрациях левитируют идеально симметричные двойные спирали ДНК. Живая клетка похожа на чистенький цех европейского завода. Вся эта красота к реальности имеет такое же отношение, как Кира Найтли на обложке Cosmopolitan к настоящей женщине. Структуру, в общем, отражает, но владение Photoshop'ом – больше. А всякий поклонник, конечно, хотел бы увидеть свою «звезду» вживую, даже пообщаться. Да, мы все еще говорим про молекулы и клетки. А еще – про лазерные технологии в биологии.
Химические методы исследования биологических объектов, вроде секвенирования ДНК и белков (определения их нуклеотидной или аминокислотной последовательности), дают представление о структуре, разрушая объекты. С клетками еще тяжелее. Жизнь – это движение. Движение белков, липидов, нуклеиновых кислот. Мир их бесчисленных взаимодействий, защищенный от «не-жизни» тоненькой плазматической мембраной. По отношению к этой хрупкой структуре современные экспериментаторы в основном оказываются в роли патологоанатомов. Химический анализ – смерть. Большинство видов излучения, применяемых в микроскопии – тоже. Электронный микроскоп, который обычно вспоминают первым, вообще требует распластать объект на срезы и зафиксировать в полимере. Остается старый добрый световой микроскоп. Но это как знакомиться с Кирой Найтли, высматривая ее с вертолета. А как же пообщаться? Путь из обидного тупика наметил в 1986 году Артур Ашкин, сотрудник американского исследовательского центра Bell Labs, создав первый в мире оптический пинцет.
Парадоксальное название инструмента вполне отражает суть. Оптический, или лазерный пинцет предназначен для захвата отдельных объектов, которые настолько малы, что сфокусированный луч света – единственное средство приложить к ним точно заданную по величине и направлению силу. Впрочем, те, кто работает с такими установками, предпочитают называть их оптическими ловушками. У лазерного пинцета нет двух «хватательных» поверхностей. Объект ловит и удерживает один луч. В упрощенном виде «матчасть» такова. Когда свет встречает на своем пути некое тело, их отношения развиваются по трем сценариям: поглощение, отражение или преломление. В последнем случае фотоны после встречи меняют траекторию, отклоняясь наружу от оптической оси (вспомните, как выглядит карандаш, до середины опущенный в воду), и одновременно передают часть импульса телу, подталкивая его в противоположную сторону. Если правильно сфокусировать луч на предмете, суммарное воздействие фотонов будет толкать его в центр луча и к точке фокуса, как бы запирая в трех измерениях. Именно это на практике осуществил Ашкин. Тогда же, в 1980-х принцип успешно попытались применить для манипуляции биологическими объектами. С тех пор технологию развивают. Например, в Петербургском политехническом университете (комплекс «Нанобиотехнологии»), где функционирует установка «Лазерный пинцет».
- В мире установок вроде нашей, наверное, пара десятков. Каждая со своими особенностями, - объясняет мне Антон Сабанцев, кандидат физико-математических наук, один из тех, кто работает с оптическим пинцетом. - Чтобы создать ловушку, нужно сфокусировать лазерный луч. Для этого идеально подходит объектив микроскопа. На первый взгляд просто, но, чтобы все это заработало, к серийному микроскопу нужно «прикрутить» кучу деталей. Получается комплексная установка, спроектированная для конкретных исследований.
- Это как купить серийный автомобиль и превратить его в гоночный болид?
- Скорее, в экскаватор. Основная функция превращается в побочную. Наш пинцет – это два пучка инфракрасного лазера мощностью 5 Вт, длина волны 1064 нм. Тип лазеров – Nd:YAG (твердотельный лазер, в качестве активной среды используется алюмо-иттриевый гранат «YAG», легированный ионами неодима Nd – Авт.). Инфракрасный лазер используется по одной причине: это ограничение, которое накладывает работа с биологическими объектами. Чтобы создать оптическую ловушку, нужно довольно много света туда запустить, а в итоге он фокусируется в пятнышко размером около микрона. Плотность мощности становится приличная. И если мы туда запустим, скажем, синий свет (меньшая длина волны, большая энергия фотонов – Авт.), у нас все шансы вскипятить воду, которая и является средой для наших объектов. А в ближней ИК-области у воды есть окно прозрачности. То же касается и биологических объектов, которые в значительной степени состоят из воды. Хотя ловушку можно сделать из света любого спектра.
Основное помещение научно-исследовательского комплекса «НаноБио» похоже на биологическую лабораторию. На столах пробирки, перчатки. По соседству стоят инкубаторы, где развиваются какие-то сложные отношения между ДНК и ферментами. Нам же – по коридору и в подвал. В небольшой комнате – рабочее место с компьютером и нечто, напоминающее огромный стол, на котором «расставлены» микроскоп и целая куча устройств. Свет в ИК-спектре человеческим глазом не воспринимается, и хотя луч, прежде чем попасть в объектив микроскопа, проходит сложную траекторию над «столом» через зеркала и линзы, рассчитывать на «лазерное шоу» нечего.
В теории все самое интересное – на мониторе. Но я вижу только два темных пятнышка на светлом фоне.
- Это микросферы из пластика. Шарики маленькие, - Антон продолжает знакомить меня с тонкостями механических действий в микромире. - Размером от 1 микрона до 5. Просто перетаскивать молекулы с места на место неинтересно. Но если приделать к ним «ручку», мы можем за нее подергать и посмотреть, как они отреагируют. Например, молекулу ДНК можно поймать за оба конца и посмотреть, как она реагирует на натяжение, выяснить ее механические свойства. Самое главное, так можно узнать, как на физическом уровне реализуется какой-то процесс, который мы в пробирке воспроизводим химически.
Анатолий Арсениев готовит образцы для эксперимента на "Лазерном пинцете"
- А как эти свойства измерить?
- На монитор выводится изображение с камеры микроскопа. Мы видим шарик, который попадает в ловушку, и можем измерять его перемещения. А шарик в оптической ловушке ведет себя, как груз на пружине: чем дальше отошел от центра, тем большая сила на него воздействует. Если молекула тянет шарик в определенную сторону, он сместится в точку, где сила молекулы будет уравновешена силой со стороны ловушки. Измерив это смещение, мы можем сказать, что вот сейчас его молекула тянет с силой в 20 пикоНьютонов, например. Получается маленький динамометр.
- Как молекула крепится к микросфере?
- Есть молекулы, которые умеют находить «напарника» и связываться с ним. Например, два белка – авидин (которого много в птичьих яйцах) и стрептавидин (его вырабатывают некоторые бактерии) – связываются с витамином В7, биотином. Мы берем и химически «пришиваем» к молекуле ДНК с двух концов витамин В7. А к шарикам прикреплен белок стрептавидин. Дальше, когда пролетает мимо шарика молекула ДНК с биотином на конце, она цепляется за этот шарик, и ее уже сложно оторвать.
С ПОМОЩЬЮ оптического захвата можно прицельно воздействовать на объекты микромира. Но манипуляции проводятся под контролем все того же светового микроскопа – иначе говоря, мы все еще высматриваем Киру Найтли с вертолета. Закономерный вопрос: а почему изображение нельзя просто увеличить еще в сотню-другую раз, чтобы в подробностях рассмотреть, как работают ДНК, белки и прочие молекулы, образующие жизнь?
Инфракрасный лазер проходит через систему линз и зеркал, но человеческий глаз его не различает
Что изучают на установке «Лазерный пинцет»?
• Механические свойства молекулы ДНК и ее взаимодействие с белками. "Если приложить достаточную силу, около 60 пиконьютонов, двойная спираль ДНК развертывается и превращается в две отдельные нити, - объясняет сут Георгий Побегалов. - При этом молекула удлиняется. Метод оптического пинцета позволил показать, что в это время там происходит раскручивание и образование локальных разрывов. Другой момент – взаимодействие ДНК с белком. Можно белок пометить флуорофором и увидеть, как он связывается с ДНК. Посмотреть, как из коротких молекул, мономеров, в точках нуклеации образуются белковые «нити» - филаменты."
• Скелет» клетки. "Мы изучаем бактериальный цитоскелет методом субдифракционной микроскопии, - рассказывает аспирант Алексей Ведяйкин. - Один из белков цитоскелета – ftsZ. Бактерии, у которых он не синтезируется, удлиняются до нескольких десятков микрон вместо 2-4, но не могут разделиться. Причины две: первая – мутация, вторая – SOS-ответ. Когда у бактерии повреждена ДНК, высока вероятность, что при делении образуются две нежизнеспособные клетки. Процесс останавливается, пока ДНК ни будет отрепарирована. SOS-ответ во многом помогает бактериальным клеткам пережить воздействие антибиотиков." • Мембраны раковых клеток. Цитоскелет напрямую связан с мембраной клетки. От их свойств зависит, сможет ли клетка противостоять воздействию внешней среды. Аспирантка Наталья Морозова с помощью лазерного пинцета проверяет прочность мембраны раковых клеток печени человека: "У мембраны есть такие характеристики, как натяжение и вязкость. Они различаются у нормальных и раковых клеток. До сих пор эти параметры мерили не на клетках, а на выделенных фракциях их мембран. Мы же прикрепляем к конкретной клеточной мембране микросферу, а потом ее оттягиваем. Между шариком и клеткой образуется тонкая трубка из мембраны. И мы можем измерить силу их взаимодействия при разных условиях." • Бактериальная «самооборона». "Некоторые бактерии обладают системой рестрикции-модификации – механизмом, позволяющим остановить атаку на колонию вируса-бактериофага. У бактерий, владеющих этой системой, с ДНК взаимодействуют два фермента, - объясняет Наталья Морозова. - Метилаза добавляет в определенных местах ДНК метильную группу (CH3). А рестриктаза режет ДНК в тех же местах, если метильной группы там нет. Это своего рода «охранная грамота». Когда клетку заражает вирус, его ДНК не метилирована, и рестриктаза разрушает чужеродный генетический материал. Но бывает, что система дает сбой, и ДНК бактериофага метилируется. Значит, его потомство сможет заразить другие клетки. Мы встраиваем в клетки E.Coli меченные ферменты. И на их примере при помощи флуоресцентной микроскопии выясняем, случаен ли этот процесс, или есть клетки-предатели, в которых, например, метилазы больше, чем рестриктазы." • Транскрипция ДНК. Информация, записанная в ДНК, превращается в белки через несколько биохимических процессов. Один из них – синтез РНК на ДНК-матрице, которым заведует фермент РНК-полимераза. Их взаимодействие на «Лазерном пинцете» изучает Анатолий Арсениев: "Я пытаюсь отследить динамику движения полимеразы по молекуле ДНК. Конструирую небольшую молекулу по схеме: промотер (химический «старт»), ген, терминатор («стоп»). Заранее известна «дистанция». ДНК крепится «хвостом» к большой полимерной частице, а полимераза «сажается» на шарик поменьше. Когда начинается синтез, по тому, как меняется расстояние между шариками, можно судить о скорости движения полимеразы. Статистика экспериментов позволит понять, зависит ли эта скорость от последовательности «букв»-нуклеотидов, по которым проходит полимераза, или от действия внешних факторов."
ГРАНИЦА запретной зоны зовется «дифракционный предел разрешения» и является побочным эффектом волновой природы света. Разрешение – термин, знакомый нам из цифровой техники. Измеряется оно количеством пикселей – условно, светящихся точек, формирующих изображение. В сущности, все, что мы видим, можно разбить на такие точки. И если бесконечно увеличивать одну из них, в какой-то момент окажется, что точка – уже не точка. Излучаемый ею свет образует дифракционную картину: вокруг самого яркого пятна, диска Эйри, расходятся менее яркие концентрические кольца – как волны от брошенного в воду камня. Объект, который мы хотим рассмотреть, состоит из точек-камней, но все, что мы видим – это волны. Как при таких условиях отличить булыжник от высыпанного разом мешка гальки? Минимальный различимый для микроскопа размер «камешков» регламентирован по всей строгости физических законов. Он должен быть больше, чем половина длины волны видимого света – 200 нм. Для сравнения, размер какого-нибудь белка «в поперечнике» - около 10 нм. Проще говоря, ни черта не видно. Если, конечно, не обхитрить дифракционный предел. Например, бросать «камешки» по очереди. В мире аналогий «на двух пальцах» идея кажется немудрящей, но те, кто придумал, как осуществить это на уровне молекул, в 2014 году получили за свое открытие коллективного «нобеля» по химии. Еще раз поаплодируем румыну с немецкой «пропиской» Штефану Хеллю и американцам Эрику Бетцигу и Уильяму Мернеру, а сами вернемся в Политех, где методы субдифракционной микроскопии реализовались, когда будущие лауреаты еще и не готовились толкать речь перед Нобелевским комитетом.
КУПИТЬ машину, превратить в экскаватор и сделать так, чтобы на нем можно было участвовать в «Формуле-1». Примерно так звучит для меня история дальнейшего «апгрейда» установки «Лазерный пинцет», которую рассказывает Антон:
- Обычная бактерия видна в микроскоп, как размазанная точка. Только увеличив разрешение, мы можем понять, что происходит внутри. И, конечно, когда эту машину создали, мы решили на ней реализовать метод флуоресцентной микроскопии, который дает разрешение на порядок лучше стандартного. Около 30 нм.
ПОЯСНИМ. «Внутренности» живых клеток трудно наблюдать в световой микроскоп не только потому, что они маленькие, но и потому, что практически прозрачные. В видимом диапазоне они мало чем отличаются от воды, в которой находятся. Как у медузы в море, у них нет контраста со средой. Но когда медузы становятся самыми яркими морскими гадами? Когда ночью святятся в воде. Подсветить клетки можно, например, используя способность биомолекул преломлять свет или менять его поляризацию (так устроены конфокальный и поляризационный микроскопы). Но можно напрямую сообщить клеточным структурам свойство светится.
Соединения-флуорофоры могут химически связываться с молекулами. Но, в отличие от люминофоров медузы, их свечение запускают не химические процессы. «Родовой» признак флуорофоров – поглощая свет с одной длиной волны, испускать его в другом, более длинноволновом диапазоне. При этом «стимул» и «ответ» для каждого соединения известны заранее. А значит, флуоресценцией в клетке можно управлять. Чтобы бросать «камешки» по очереди и сложить подробную картинку в обход строгих физических законов.
ПЕРВЫЙ РЕАЛИЗОВАННЫЙ МЕТОД
флуоресцентной микроскопии сверхразрешения придумал как раз Штефан Хелль в 1994 году. Он получил название STED – Stimulated Emission Depletion, уменьшения (подавления) вынужденного излучения. В нем один лазерный луч возбуждает флуоресценцию в молекулах, а другой, проходящий вокруг него, подавляет. То есть когда одна точка светится, ее соседи молчат, не мешая определять ее положение собственной дифракционной картиной. Так «двуслойный» луч скользит по всему объекту, постепенно рисуя его изображение.
Название метода, в основу которого легли разработки Бетцига и Мернера, перевести сложнее. GSDIM - ground state depletion followed by individual molecule return, если очень литературно – «уменьшение до базового состояния через возвращение к нему отдельных молекул». Флуоресценция здесь не подавляется, но стимулирующее излучение рассчитывается так точно, что в каждый момент светится лишь небольшое число молекул, разбросанных по объекту, затем они гаснут, и загорается следующая группа. Процесс выглядит, как сумасшедшая новогодняя гирлянда, но когда все кадры обрабатываются и собираются вместе, получается изображение с точностью локализации каждой молекулы до нанометра. GSDIM дает даже большее разрешение, чем STED – приблизительно 20 нм против 50. Его и выбрали в «НаноБио».
- У нас тут несколько лазеров с разной длиной волны, - поясняет мне Георгий Побегалов, еще один аспирант лаборатории. Работа Георгия связана как раз с флуоресцентно меченной ДНК:
- Лазеры используются для возбуждения флуоресценции разных цветов. Флуорофоры бывают различными по химической природе, по особенностям взаимодействия с макромолекулами. Например, я использую краситель, который становится флуоресцентным, только встраиваясь в ДНК. Если он принимает квант света «на свободе», эту энергию он реализует в каком-то движении. А если он встроен в ДНК, ему не двинуться, и он начинает светиться, отдавая энергию. - На реализацию метода флуоресцентной микроскопии на нашей установке ушло несколько лет, - продолжает Антон. И сейчас мы это направление активно развиваем. Уже решаем задачи совместно с биологами. Например, пытаясь разобраться, как устроена микоплазма, самая маленькая бактерия.
- Исследования, связанные с клетками, сосредоточены в основном на бактериях?
- Это и бактерии, и эукариотические клеточные культуры, и раковые клеточные линии... Но многие работы действительно связаны с прокариотами. В углубленных исследованиях, касающихся подробностей жизни клетки, чем проще объект, чем лучше он изучен, тем лучше. Бактерия E.Coli (кишечная палочка – Авт.), наверное, самый изученный организм на планете. Поведение эукариотической клетки сложнее предсказать. В ней больше процессов, нужно учитывать больше факторов – уравнение с большим количеством переменных. Но эукариоты – это, конечно, по-настоящему захватывающая работа.
Установка «Лазерный пинцет» и работа, кипящая вокруг нее, - многообещающий роман между физикой и биологией. Но пока «влюбленные» переживают конфетно-букетный период:
- Людям, которые работают в нашей лаборатории, в первую очередь интересна сама технология, - говорит Антон Сабанцев. – Мы выходим на контакт с биологами, уже отработав какие-то методы, пытаясь выяснить точки их применения. Ведь работа с пинцетом требует специфических знаний, тут скорее нужно быть физиком. Хотя некоторые биологи приходят сами, узнав о возможностях установки. Но почти всегда люди впервые слышат, что можно делать флуоресцентную микроскопию с разрешением в 30 нм, именно от нас. Следовательно, мало и понимания, что такое «Лазерный пинцет», чего с ним можно добиться.
А добиться, как вы уже поняли, можно многого. Особенно, если совершенствование установки будет продолжено. На этот счет у сотрудников «НаноБио» есть множество планов:
- В первую очередь, нам бы хотелось стабилизировать положение лазеров с помощью активной обратной связи, чтобы ловушка стала «жестче». Это могло бы существенно повысить точность наших измерений. Кроме того, добавить к пинцету инкубатор, который будет поддерживать нужные для живых клеток условия – тогда мы сможем проводить полноценные по времени эксперименты, в том числе с эукариотическими клетками сложных организмов.
Это новость от журнала ММ «Машины и механизмы». Не знаете такого? Приглашаем прямо сейчас познакомиться с этим удивительным журналом.
